基因重组范例

基因重组范例篇1

　　血凝素是流感的保护性抗原，它不仅诱导机体产生针对血凝素 1和血凝素 2的抗体，而且诱导CTL反应。

　　1.2.1 左青山等［1］构建了禽流感(AIV)血凝素5和血凝素9基因共表达禽痘病毒转移载体，经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化，获得了遗传性状稳定的血凝素基因重组禽痘病毒，可表达AIV的血凝素5和血凝素9基因。用该重组禽痘病毒免疫鸡后再用禽流感病毒做攻击试验，结果表明该重组病毒能全面诱导机体的细胞免疫和体夜免疫反应，对H5强毒攻击产生强的免疫保护，为进一步开展疫苗研究奠定科学的理论和实验基础。

　　1.2.2 金元昌，李景鹏等［2］利用对禽类致病性很弱的病毒作载体，构建表达了血凝素的重组病毒。用此重组病毒作为疫苗，它可在动物体内复制，并不断地表达出血凝素蛋白，从而诱导机体产生针对A IV的免疫保护力。

　　1.2.3 韦栋平刘玉良等［3］应用RT-PCR扩增出新城疫病毒F48E8株融合蛋白(F)基因，将其克隆入pGEM-T easy vector构建重组质粒pGEM-TF。分别从pGEM-TF和pUC血凝素切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株(A/chicken/china/F/1998)血凝素基因，通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF，其中F基因和血凝素基因分别由鸡痘病毒启动子P和合成启动子PS调控。该重组病毒能够同时正确表达血凝素和F蛋白。

　　1.2.4 小结

　　由于血凝素基因在机体内随着载体的复制而表达，所以同灭活苗相比疫苗用量少，又不需要添加佐剂，成本大大降低；而且免疫保护持续时间长，效果好，其最大优点是不影响该病监测和流行病学调查［4］。

　　参考文献

　　［1］ 左青山等 禽流感HA7基因DNA疫苗的构建及免疫保护效果研究 新疆农业大学学报 2007，（4）

　　［2］ 金元昌等 禽流感病毒分子生物学研究进展 动物医学进展 2003，（1）

基因重组范例篇2

　　【关键词】 疱疹病毒4型，人；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；基因，即早；基因融合；遗传载体

　　【摘要】 目的 构建粒细胞？巨噬细胞集落刺激因子(gm？csf)和eb病毒即刻早期基因(bzlf1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 采用逆转录？聚合酶链反应分别获得gm？csf和bzlf1编码序列的cdna，应用剪接式重叠延伸(soe)技术将两段基因通过多肽接头(gly4ser)3 的dna 序列进行连接，构建融合基因gm？csf？bzlf1.将融合基因gm？csf？bzlf1定向亚克隆至padtrack？cmv质粒，在原核细胞e。 coli bj5183中完成穿梭质粒与骨架质粒padeasy？1的同源重组，构建融合基因gm？csf？bzlf1真核表达载体pad？gm？csf？bzlf1.将真核表达载体pad？gm？csf？bzlf1转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vad？gm？csf？bzlf1.rt？pcr鉴定感染重组腺病毒的293细胞中gm？csf？bzlf1基因的表达。结果 gm？csf？bzlf1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置，且插入序列完全正确；感染重组腺病毒vad？gm？csf？bzlf1的293细胞中检测到融合基因gm？csf？bzlf1的转录表达。结论 成功地构建了融合基因gm？csf？bzlf1重组腺病毒表达载体，为进一步探讨gm？csf？bzlf1的功能提供了理论基础和实验依据。

　　construction of recombinant adenovirus expression vector encoding gm？csf？bzlf1 fusion gene cui ying， wang yun， liu cheng？yu， et al (qingdao university medical college， qingdao 266021， china)； [abstract] objective to construct human granulocyte？macrophage colony？stimulating factor (gm？csf) gene and ebv encoding immediate early genes (bzlf1) fused to gm？csf？bzlf1 gene and the fusion gene recombinant adenovirus expression vector。 methods gm？csf cdna and bzlf1 cdna were acquired by rt？pcr。 the fusion gene gm？csf？bzlf1 was constructed through a polypeptide linker (gly4ser) 3 by using spliced overlap extension (soe)。 the fusion gene gm？csf？bzlf1 was subcloned into padtrack？cmv plasmid。 the shuttle plasmid and the backbone plasmid padeasy？1 were recombinated homologously in e。coli bj5183 cells， then fusion gene eukaryotic expression vector pad？gm？csf？bzlf1 were constructed。 pad？gm？csf？bzlf1 vector was transfected into 293 cells to obtain recombinant adenovirus vad？gm？csf？bzlf1. rt？pcr was used to identify the expression of fusion gene gm？csf？bzlf1 in 293 cells infected with vad？gm？csf？bzlf1. results the result of dna sequencing demonstrated that gm？csf？bzlf1 gene inserted in the expected site in the recombinant adenovirus expression vector and the insertion sequence was wholly correct。 the expression of fusion gene gm？csf？bzlf1 could be detected in the 293 cells infected with vad？gm？csf？bzlf1. conclusion the fusion gene gm？csf？bzlf1 recombinant adenovirus expression vector has been constructed successfully， which might furnish the rationale and experimental evidence for further study on the function of gm？csf？bzlf1 gene。

　　[key words] herpesvirus 4， human； granulocyte？macrophage colony？stimulating factor； genes， immediate？early； gene fusion； genetic vectors

　　eb病毒(ebv)是嗜b淋巴细胞的疱疹病毒，为致瘤病毒之一。文献报道，该病毒与多种人类恶性肿瘤如burkitt淋巴瘤、鼻咽癌(npc)、霍奇金病、免疫缺陷病人的b淋巴细胞瘤及胃癌等发生有关[1？4]。hoshikawa等[1]研究表明， ebv基因组存在于几乎所有ebv阳性癌组织的癌细胞中，提示ebv可能是治疗ebv阳性肿瘤的理想靶点。ebv即刻早期基因(bzlf1)是诱导潜伏期病毒活化进入裂解期的关键基因，其编码蛋白为转录激活因子，可激活病毒早期基因和晚期基因使病毒进入裂解期进行复制。ebv大量增殖后经细胞膜释放可导致肿瘤细胞溶解死亡，起到选择性杀伤ebv阳性肿瘤细胞的作用[5]。粒细胞？巨噬细胞集落刺激因子(gm？csf)主要由t细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，将gm？csf基因转入肿瘤细胞内，可以提高其免疫原性从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答[6]。本研究拟将gm？csf编码基因和bzlf1进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，深入探讨融合基因表达对ebv阳性肿瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗ebv相关肿瘤提供实验基础和理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂、质粒和细胞系

　　限制性核酸内切酶ecorⅴ和bglⅱ，t4 dna连接酶，dl 10 000 dna marker，dl 2 000 dna marker，taq dna聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司；dna转染试剂盒lipofectamine 2000 购自invitrogen公司；质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。dmem培养液、trizol、胎牛血清购自美国gibco公司。反转录酶为promega公司产品。qiaex？ⅱ纯化试剂盒购自qiagen公司。携带gfp报告基因的腺病毒穿梭质粒padtrack？cmv，e1 区和e3 区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒padeasy？1，大肠杆菌bj5183和dh10b以及人胚肾293细胞，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。ebv阳性b95？8细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。

　　1.2 引物设计

　　根据gm？csf和bzlf1开放读码框序列，以dnastar软件设计扩增人gm？csf和ebv bzlf1 基因的特异性引物，并在gm？csf上游引物的5′ 端引入bglⅱ酶切位点和保护性碱基ga，下游引物3′ 端删除终止密码tga，引入linker；bzlf1下游引物5′ 端引入ecorⅴ酶切位点和保护性碱基gc，上游引物3′ 端引入linker。linker(gly4ser)3为编码15个氨基酸组成的疏水性多肽的dna 序列，序列为5′？ggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagc？3′。gm？csf引物(上游p1、下游p2)和bzlf1引物(上游p3、下游p4)序列见表1.上述序列中下划线部分为linker，黑体部分为酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(page纯化)，扩增产物gm？csf长为470 bp，bzlf1长为785 bp，融合基因长为1 210 bp。

　　1.3 gm？scf和bzlf1基因的扩增

　　取正常人外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞。将收集的单个核细胞加入含有植物血凝素的dmem培养液中，37 ℃活化24～48 h后收集活化的单个核细胞。采用trizol一步法分别提取外周血活化的淋巴细胞总rna和ebv阳性b95？8细胞系总rna，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cdna用作pcr反应模板。pcr反应体系为25 μl，其中包括10×buffer 2.5 μl， mgcl21.5 mmol/l，dntp 0.2 mmol/l，上下游引物各0.3 mmol/l，taq dna聚合酶 1 u，cdna 2 μl，无菌去离子水补至25 μl。反应条件为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸10 min。pcr扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/l)的8 g/l琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外线透射仪下观察电泳结果。切胶回收pcr产物，用qiaex？ⅱ纯化试剂盒进行pcr产物的纯化。表1 bzlf1和gm？csf引物设计名称序列长度gm？csfp1 p1

　　1.4 目的基因的ta克隆和测序

　　分别将gm？csf和bzlf1 pcr的纯化产物与pmd18？t载体连接，转化入高效e。coli dh10b感受态细菌中，在含有x？gal和iptg的氨卞青霉素lb平板上进行蓝白斑选择。分别将ta？gm？csf和ta？bzlf1阳性克隆送北京华大基因研究中心进行dna序列测定，测序结果与genbank中gm？csf和ebv标准株bzlf1编码基因序列进行比对。

　　1.5 融合基因gm？csf？bzlf1的构建

　　以ta？gm？csf和ta？bzlf1质粒为模板进行pcr扩增反应，分别获得带有linker互补序列的gm？csf和bzlf1片段。将gm？csf和bzlf1的pcr产物行琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，以其为模板采用重叠延伸pcr法[7]获得融合基因片段gm？csf？bzlf1.重叠延伸pcr反应体系容积为50 μl， 包括10×buffer 5 μl， mgcl2 3 mmol/l，dntp 0.4 mmol/l，上下游引物p1、p4分别为0.5 mmol/l，高保真taq dna聚合酶2.5 u，模板2 μl，无菌去离子水补至50 μl。反应条件为：95 ℃预变性2 min；然后95 ℃ 45 s、58 ℃ 45 s、72 ℃2 min，扩增35个循环；最后72 ℃延伸10 min。延伸结束以后，向pcr体系中加入datp 2 mmol/l，taq dna聚合酶 1 u，继续72 ℃延伸30 min。将纯化后的gm？csf？bzlf1融合基因片段插入到pmd18？t载体进行ta克隆，提取质粒dna进行酶切鉴定和dna序列分析。

　　1.6 重组腺病毒pad？gm？csf？bzlf1的构建

　　质粒ta？gm？csf？bzlf1和腺病毒穿梭质粒pad？cmv分别用ecorⅴ和bglⅱ进行双酶切，连接后转化dh10b高效感受态细菌中，培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒dna进行padtrack？cmv？gm？csf？bzlf1重组体的pcr筛选及酶切鉴定。

　　重组padtrack？cmv？gm？csf？bzlf1质粒用限制性核酸内切酶pmeⅰ酶切线性化，并用碱性磷酸酶将线性化质粒去磷酸化，与1 μl(0.1μg)的padeasy？1质粒同时转化感受态e。coli bj5183，将转化的bj5183 感受态菌液涂布于含35 mg/l卡那霉素的lb平板，37 ℃培养16～20 h。挑取较小菌落，在含卡那霉素(35 mg/l)的lb液体培养基中37 ℃振摇培养12～16 h，碱裂解法小量提取质粒dna，用限制性内切酶pacⅰ酶切后电泳进行鉴定，阳性质粒命名为pad？gm？csf？bzlf1.构建好的重组腺病毒载体经过测序鉴定，证明插入的序列正确无误。

　　1.7 重组腺病毒的制备

　　在25 cm2培养瓶中常规培养293细胞，当细胞生长至50%～70%融合时弃去培养基，按照脂质体转染试剂盒(lipofectamine 2000)使用说明书，将带有gm？csf？bzlf1融合基因的重组腺病毒载体转染293细胞。在观察到细胞荧光出现5～7 d后收获细胞，反复冻融3次裂解细胞，离心除去细胞碎片，取上清再次接种293细胞，如此重复3～4 次。

　　1.8 rt？pcr检测gm？csf？bzlf1 mrna

　　用重组腺病毒vad？gm？csf？bzlf1感染293细胞，3 d后收集细胞，1 000 r/min 离心10 min，弃上清。采用trizol一步法提取细胞总rna，所获rna加dnaseⅰ消化处理可能污染的dna后进行rt？pcr检测。作为对照，提取未感染重组腺病毒的293细胞rna进行rt？pcr，pcr产物于琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 目的基因的rt？pcr扩增

　　结果显示，人外周血淋巴细胞gm？csf和ebv阳性b95？8细胞bzlf1编码序列cdna的pcr产物长度分别为470 bp和785 bp(图1)。序列分析示，gm？csf和bzlf1编码序列cdna与genbank中标准株相应序列一致。

　　2.2 融合基因pcr电泳和测序结果

　　融合基因gm？csf？bzlf1的pcr扩增产物长度为1 210 bp。琼脂糖凝胶电泳显示，与dna标准分子质量参照物dl 15 000比较，与预测结果一致(图2)，测序结果与gm？csf、bzlf1以及linker的核苷酸序列一致。

　　m：dl 2 000相对分子质量标准；①、②gm？csf基因pcr 产物(470 bp)；③、④bzlf1 基因pcr 产物(785 bp)；⑤阴性对照。

　　图1 目的基因的pcr扩增产物

　　m：dl 15000相对分子质量标准；①～⑥gm？csf？bzlf1基因pcr产物；⑦阴性对照。

　　图2 融合基因gm？csf？bzlf1的pcr扩增产物

　　2.3 腺病毒质粒穿梭载体padtrack？cmv？gm？csf？bzlf1的鉴定

　　质粒ta？gm？csf？bzlf1经bgl ⅱ和ecor ⅴ双酶切后定向亚克隆入穿梭载体padtrack？cmv，构建重组质粒padtrack？cmv？gm？csf？bzlf1，提取质粒padtrack？cmv？gm？csf？bzlf1行限制性核酸内切酶bgl ⅱ和ecor ⅴ双酶切分析，得到长1 210 bp的融合基因片段和约9 200 bp的片段(图3)。

　　2.4 融合基因gm？csf？bzlf1真核表达载体的构建和鉴定

　　padtrack？cmv？gm？csf？bzlf1与padeasy？1质粒共转化感受态e。 coli bj5183发生同源重组获得pad？gm？csf？bzlf1重组体，对pad？gm？csf？bzlf1重组体测序分析表明，pad？gm？csf？bzlf1真核表达载体构建成功，融合基因gm？csf？bzlf1片段插入正确。重组腺病毒载体携带2个独立的cmv启动子表达盒，分别表达融合基因gm？csf？bzlf1和gfp；转染48 h后即在荧光显微镜下观察到293细胞中gfp荧光，可间接反映融合基因的表达。随传代次数增加，重组腺病毒感染性稳定且增强，致细胞病变作用的时间缩短，通常传至4～5代时，在接种病毒后24～48 h，可观察到几乎所有细胞均出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vad？gm？csf？bzlf1.提取重组腺病毒感染293细胞总rna经rt？pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳显示特异性1 210 bp预计大小的片段(图4)，表明重组腺病毒在293细胞能有效转录。

　　3 讨 论

　　ebv相关肿瘤组织中ebv只存在于癌细胞而正常细胞阴性，使靶向基因治疗ebv相关肿瘤有可能通过ebv而实现。由于在ebv阳性的肿瘤细胞中，病毒通常以潜伏形式存在，并不影响宿主细胞的正常代谢，因此诱导其进入裂解期，进而特异性杀伤ebv阳性肿瘤细胞，有望成为治疗ebv相关肿瘤新的手段。

　　近年来许多研究结果表明，bzlf1表达可诱导病毒潜伏期活化进入裂解期，bzlf1编码蛋白为转录激活因子，可诱导潜伏状态的ebv进入裂解期复制[8]。孙淑红等[5]研究显示，携带外源性bzlf1基因的重组腺病毒能有效感染ebv阳性上皮细胞，进而诱导细胞潜伏期ebv进入裂解期进行复制，ebv增殖后经细胞膜释放最终可以特异性地杀伤ebv阳性肿瘤细胞。

　　细胞因子基因免疫是目前肿瘤基因治疗研究的热点，将具有抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使体内持续存在一定水平的内源性细胞因子以发挥抗肿瘤的作用。gm？csf是一种重要的免疫调节分子，它不仅可诱导在t细胞免疫反应中起关键作用的dc细胞成熟、分化，而且在免疫治疗过程中可增强主要和次要的抗体反应，以促进dc等apc分化、成熟和活化及上调cd86的表达水平，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和adcc效应等活性；促进th、tc、nk细胞在肿瘤部位浸润，抑制肿瘤细胞的生长。gm？csf强烈激活特异免疫反应这一突出作用可用于肿瘤治疗。nakamura等[9]用腺病毒将表达于ct26细胞中的鼠内源性肿瘤抗原基因gp70和gm？csf转导入小鼠骨髓dcs， 由于gm？csf转入表达肿瘤相关抗原的dcs细胞，能够提高dcs细胞趋化因子cc亚族受体7的表达，而增强dc细胞迁移进入引流淋巴结的能力，从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答。qiu等[10]通过重组腺病毒将p53和gm？csf基因共转导入人喉癌hep？2细胞，发现可以有效诱导肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤特异性tc细胞大量浸润并抑制hep？2细胞的增长。

　　已经有研究证实，将细胞因子基因gm？csf转入肿瘤细胞可使肿瘤细胞的免疫原性增强而致瘤性下降，从而提高诱导机体特异性的抗肿瘤免疫反应，但是该作用不够强大，对已发生的肿瘤治疗效果较差。为此，我们综合肿瘤基因治疗和细胞因子基因治疗的作用特点，将bzlf1基因和gm？csf基因融合后构建重组腺病毒表达载体，同时发挥bzlf1基因靶向杀伤ebv阳性癌细胞和gm？csf基因增强机体的抗肿瘤免疫作用。该融合基因载体可以在基因水平上对bzlf1和gm？scf基因拷贝数进行控制，精确控制两种功能性蛋白的比例，以达到最佳治疗效果，从而为探讨融合基因协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞的作用奠定实验基础。

　　本研究将gm？scf和bzlf1基因进行融合，成功构建了重组腺病毒表达载体。基因融合采用经典的重叠延伸pcr法，使用柔性连接子(linker)将gm？csf和bzlf1基因相连，简化了基因融合过程。而表达载体则采用当今广泛应用的adeasy系统，该系统可在原核细胞e。 coli bj5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，使得载体的构建程序快速而有效。

　　重组腺病毒表达载体经293细胞包装获得重组腺病毒vad？gm？csf？bzlf1，rt？pcr鉴定结果表明vad？gm？csf？bzlf1重组腺病毒可在293细胞中有效转录。为进一步探讨该融合基因在ebv阳性肿瘤细胞的表达，同时发挥gm？scf基因增强抗肿瘤免疫和bzlf1基因诱导潜伏期ebv进入裂解期复制的作用，进而协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞奠定了实验基础。

　　[1]hoshikawa y， satoh y， murakami m， et al。 evidence of lytic infection of epstein？barr virus (ebv) in ebv？positive gastric carcinoma[j]。 j med virol， 2002，66(3)：351？359.

　　[2]fukayama m， ibuka t， hayashi y， et al。 epstein？barr virus in pyothorax？associated pleural lymphoma[j]。 am j pathol， 1993，143(4)：1044？1049.

　　[3]macmahon e m， glass j d， hayward s d， et al。 epstein？barr virus in aids？related primary central nervous system lymphoma[j]。 lancet， 1991，338(8773)：969？973.

　　[4]梁华，罗兵，王云，等。 胃癌和相应癌旁组织中eb病毒感染的检测[j]。 青岛大学医学院学报， 2003，39(4)：428？430.

　　[5]孙淑红，王云，王笑峰，等。 ebv即刻早期基因bzlf1腺病毒表达载体的构建及初步应用[j]。 中华微生物学和免疫学杂志， 2007，27(6)：555？559.

　　[6]洪晓武。 gm？csf协同抗肿瘤作用研究进展[j]。 j practical oncology， 2003，18(2)：154？156.

　　[7]weiss l m， movahed l a， warnke r a， et al。 detection of epstein？barr viral genomes in reed？sternberg cells of hodgkin’s disease[j]。 n engl j med， 1989，320(8)：502？506.

　　[8]feng w h， israel b， raab？traub n， et al。 chemotherapy induces lytic ebv replication and confers ganciclovir susceptibility to ebv？positive epithelial cell tumors[j]。 cancer res， 2002，62(6)：1920？1926.

基因重组范例篇3

　　【关键词】基因重组乙肝疫苗；免疫效果；持久性

　　基因工程乙肝疫苗在我国大量生产及应用，经许多研究证实该疫苗具有良好的近期保护效果，但在我国广泛使用的时间不长，对基因疫苗免疫持久性和保护期限问题，国内外研究甚少，为了进一步考核其免疫效果和免疫持久性，本文对及时全程完成基因重组乙肝疫苗基础免疫的儿童资料进行整理分析，报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　调查对象为3～5岁儿童，化验标本为静脉血3ml。所有儿童出生时母亲HBsAg阴性，已严格按0、1、6程序全程接种注射重组酵母基因工程乙肝疫苗，注射部位为上臂三角肌肌肉，注射剂量为5μg/人次，疫苗由深圳维康生物工程公司生产。

　　1.2 方法

　　采用酶联免疫ELISA法，测试指标为HBsAg、抗- HBs与抗-HBc，试剂由北京万泰生物药业有限公司提供，结果判断标准：S/N≥2.1判为HBsAg阳性，CO/S≥2.0判断抗-HBc阳性；血清抗-HBs滴度≥10mIU/ml时，判为阳性；血清抗-HBs滴度≤10mIU/ml时，判断为阴性。

　　2 结果

　　2.1 接种后不同时间的免疫情况

　　见表1.根据免疫后的时间不同，分为3个组，本组资料显示，接种后半年之内，抗-HBs的阳性率可以达到96.19%，几何平均滴度(GMT)为68.34mIU/ml，但是随着免疫后时间的延长，抗-HBs有效阳性率和GMT均呈现逐年下降的趋势，4年后的抗-HBs有效阳性率、GMT分别下降至40.27%和8.76mIU/ml，将各组之间进行比较，各组之间的差别均有显著的统计学意义(P＜0.01)；将各组之间有效阳性率回归分析发现全程免疫后的时间与抗-HBs有效阳性率之间存在线性关系(P＜0.01)。表1 全程免疫接种后不同时间的免疫情况（略）

　　2.2 接种后不同时间的HBsAg、抗-HBc、HBV感染情况

　　见表2.通过观察发现，接种免疫之后1年之内，没有发现HBsAg阳性的携带者，1年之后出现HBsAg携带者，分析没有发现各组之间的HBsAg阳性率没有统计学差别；HBV感染似乎存在逐年上升的趋势，统计学分析同样发现各组之间HBV感染没有明显的统计学差别。表2 接种后不同时间的HBsAg、抗-HBc、HBV感染情况（略）

　　3 讨论

　　新生儿出生后24h内开始接种首剂乙肝疫苗并按0-1-6程序完成3针免疫，经大量研究证实的最佳免疫程序，无特殊情况都应执行这一免疫方案和程序［1］。本组资料显示，严格接种之后半年内，抗-HBs的阳性率可以达到96.19%，虽然随着免疫后时间的延长，抗-HBs有效阳性率和GMT均呈现逐年下降的趋势，但是2年之内的抗-HBs的阳性率依旧保持在60%以上，5年之内的抗-HBs有效阳性率可以保持在40%以上，说明乙型肝炎基因重组疫苗全程接种具有良好的免疫保护效应，与国内邓韶英［2］的报道接近。

　　本组观察的结果显示，接种后抗-HBs水平在1年后会显著下降，本组的数据虽然比国内文献报告的偏低［3］，然而分析发现，虽然抗-HBs水平在逐渐下降，但是5年内HBsAg携带率、抗-HBc阳性率、HBV感染率并没有出现随免疫时间延长而增长，说明疫苗全程免疫后可产生较持久的免疫效果，具体的机制尚有待于进一步研究。由此也可见，判断疫苗的苗疫效果应该综合判断，也不能单纯依赖于抗-HBs的水平来判断免疫的效果。正如学者王继杰等［4］研究后认为，新生儿乙肝疫苗全程接种后，抗-HBs阳转率随着时间的推移而逐步下降，但即使抗-HBs降至保护性抗体水平以下，其抗-HBs阳性率仅为 1.38%，与免疫后1年相比差别无显著性意义，说明乙肝疫苗具有持久的预防保护效果。

　　幼儿是HBV易感染和高发年龄组，其感染有两个高峰期，第一个高峰期在1岁内，主要是母婴传播；另一个高峰期是学龄前，10岁以后感染率明显下降［5］。因此出生后全程接种注射重组酵母基因工程乙肝疫苗是十分重要的，目前在我国也已经基本普及。但是学龄前同样存在一个感染高峰，是否需要加强注射、什么时间进行加强注射呢，目前还没有统一的观点，有学者认为乙肝疫苗接种后，当抗-HBs低于 10mIU/ml时，需要进行加强免疫，但也有学者认为对乙肝疫苗有应答者，即使抗-HBs水平低至不能检出，其预防作用尚可持续数年，故无需加强。本组资料显示5年之内HBV的感染率同1年相比，没有明显的差别，暂时没有加强接种的必要，但是5年之后的情况目前还没有观察，希望广大医务工作者能进行长期的跟踪观察。

　　【参考文献】

　　1 卫生部全国乙肝疫苗免疫接种实施方案。中国计划免疫通讯，1992，(4)： 2-3.

　　2 邓韶英，柯建厚，孙亚军，等。乙型肝炎基因重组疫苗免疫效果及持久性观察。实用预防医学，2005，12（6）：1321.

　　3 翟如芳，李国英，李太生，等。重组(酵母)乙型肝炎疫苗免疫后6年的效果观察。中国计划免疫，2004，10(5)：264-266.

基因重组范例篇4

　　本节课包含了基因突变和基因重组，而前面已经学习了自由组合定律和减数分裂，学生对基因重组已经有了一定的了解，在这个知识点应注重对学生理解能力和图形分析能力的培养。这节课的重点集中于基因突变，要通过多种途径来加深对基因突变的理解。

　　二、教学目标

　　1.识目标

　　基因突变的概念、特点和意义；

　　2.能力目标

　　通过游戏、模型演示推出基因突变概念，锻炼学生合作探究的能力。

　　3.情感态度价值观目标

　　通过分析引起基因突变的外部原因培养学生正确的生活态度，珍惜爱护生命。

　　三、学习重点及难点

　　1.教学重点

　　基因突变的概念和特点及原因。

　　2.教学难点

　　基因突变的概念

　　四、教学方法及教具

　　讨论法。分析归纳法。

　　教具：多媒体。游戏纸条。

　　五、课时安排

　　1课时

　　六、教学过程

　　（一）基因突变

　　游戏导入：把学生分成4排，给每排第一个学生发一个纸条，上面写了THECAT SATONTHEMAT。由每排第一个同学看完口头往后传，每排最后一个同学回报结果，结果有的同学丢了一个单词或一个字母，有的增添了字母。

　　教师设疑：如果将原句想象成DNA分子，将错句想成出错的DNA分子，将字母想象成碱基，基因突变有哪些类型？

　　教师导出基因突变的概念。

　　1.概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变。

　　2.发生时期：有丝分裂间期、减数第一次分裂前的间期。

　　设疑：基因突变的三种类型一定会引起生物性状的改变么？

　　（1）碱基对替换：

　　呈现：正常红细胞和异常红细胞的图片。大家知道，性状是由蛋白质来体现的。

　　多媒体呈现：血红蛋白分子的部分氨基酸组成

　　正常……缬氨酸――组氨酸――亮氨酸――苏氨酸――脯氨酸――谷氨酸――谷氨酸――赖氨酸――

　　异常……缬氨酸――组氨酸――亮氨酸――苏氨酸――脯氨酸――缬氨酸――谷氨酸――赖氨酸――

　　教师：找出发生镰刀型细胞贫血症的原因？

　　学生：谷氨酸被缬氨酸替换。

　　教师：氨基酸的密码子是由DNA分子决定的，那相应的DNA分子的碱基发生了什么变化？

　　学生分析后回答：T//A 被A//T取代。

　　碱基对替换一定会引起生物性状的改变么？

　　分析以下情况

　　学生：两种密码子决定的都是谷氨酸，不会引起性状改变。

　　教师点拨：密码子有简并性，碱基对的替换不一定会导致生物性状的变化。

　　（2）碱基对的增添或缺失：

　　设计模型，利用磁条构建一个含有6个碱基对的DN段。

　　学生：以小组为单位，随机在这个片段中增添、缺失一个碱基对，推测相应的氨基酸序列，观察生物性状有什么变化？若增添、缺失两个或三个碱基对呢？完成学案上几种情况。总结规律。

　　如果人体某些细胞发生基因突变，有可能发展为癌细胞。生活中有什么因素容易引发癌症？

　　学生举例：强日光照射下容易得皮肤癌；放射室工作的医生容易得癌症等。

　　4.外因： ①物理因素 ②化学因素 ③生物因素

　　5.特点：阅读学案上资料，师生共同归纳。

　　基因突变有何意义？

　　引导学生思考、分析：

　　①基因突变能产生新基因吗？

　　②基因突变对生物进化有何意义？

　　（二）、基因重组

　　多媒体呈现

　　图片1：“一母生九子，连母十个样”

　　图片2：我们一家三口（丈夫。女儿和我）的照片

　　教师：生物子代与亲代之间，子代与子代之间存在差异的原因？

　　教师导出基因重组概念。

　　学生：重温基因自由组合及减数分裂的知识，完成学案基因重新组合情况，归纳产生基因重组原因。

　　课堂小结：

　　一、基因突变

　　1.概念：碱基对的替换、增添、缺失，引起的基因结构的改变。

　　3.原因：内因、外因。

　　4.特点：①普遍性②随机性③低频性④多害少利⑤不定向性

　　5.意义：产生新基因，生物变异的根本来源，生物进化的原始材料。

　　二、基因重组

　　1.概念：控制不同性状的基因重新组合。

　　2.意义：生物变异的来源之一，对生物进化具有重要意义。

基因重组范例篇5

　　【关键词】 乙型肝炎病毒；，RNA干扰；，腺病毒；，基因治疗

　　Preparation of recombinant adenovirus mediated siRNA targeting HBVx gene and its suppressive effect on HBVx gene expression

　　【Abstract】 AIM： To construct the recombinant adenovirus vectors for siRNA targeting HBVx gene （HBx） and to evaluate the inhibitive effect on the expression of HBx gene in human hepatoma HepG2 cell line。 METHODS： The shuttle vector pShuttleHBx was cotransfected into E。 coli BJ5183 with adenovirus backbone plasmid。 The homologous recombinants were transfected into HEK293 packaging cells and adenovirus was packaged and amplified， followed by infection of the HepG2 cells transfected with HBx gene。 The expression levels of HBx were determined by RTPCR and Western Blot after the total RNA and protein were collected。 RESULTS： The recombinant adenoviral vectors containing siRNA targeting HBx gene were successfully constructed， which were confirmed by restriction enzyme digestion。 RTPCR results demonstrated that the HBx mRNA was markedly decreased and Western Blot results showed that the expression of HBx protein was also significantly reduced in HepG2 cell line。 CONCLUSION： Adenovirusbased siRNA targeting HBx gene can inhibit HBx expression with great potency and specificity in vitro。

　　【Keywords】 hepatitis B virus； RNA interference； adenovirus； gene therapy

　　【摘要】 目的：构建针对乙型肝炎病毒x基因（HBx基因）的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体，并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用。 方法：重组腺病毒穿梭载体pShuttleHBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体，后者转染HEK293细胞，包装并扩增出病毒颗粒。 用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2，收集细胞总RNA和总蛋白，采用RTPCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化。 结果：经限制性内切酶酶切鉴定，证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功。 RTPCR和Western Blot方法证实，在HepG2细胞中，HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低。 结论：腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达。

　　【关键词】 乙型肝炎病毒；RNA干扰；腺病毒；基因治疗

　　0　引言

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）基因组中，HBx基因编码的HBX蛋白是HBV编码蛋白中唯一具有多种调控功能的病毒蛋白质［1-2］，可以激活宿主细胞中受损DNA的修复［3-4］，并且同多种肿瘤相关分子有相互作用。 因此认为，HBX与肝细胞肝癌的发生和发展密切相关。 RNA干扰(RNA interference， RNAi)是双链RNA (doublestrand RNA， dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing， PTGS）现象，其主要生物学功能在于抵抗病毒感染，维持基因组中转座子的稳定性，清除异常RNA，并参与基因表达的调控［5-6］。 我们构建针对HBx基因重组腺病毒干涉载体，在人肝癌细胞株HepG2中检测其对HBx基因表达的抑制效果，为乙型肝炎病毒感染以及感染后发生的肝细胞肝癌的基因治疗提供新思路。

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　含有针对HBx基因的两个干涉靶序列的干涉表达质粒pSUPERHBx2，pSUPERHBx5（干涉序列分别针对HBx基因的301~319位和198~216位），表达HBx基因的质粒pCNDA3.1HBxmyc，对照载体AdeasyH1，pCDNA3EGFP，大肠埃希菌DH5α，HEK293细胞以及人肝癌细胞HepG2（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）。 pAdeasy1腺病毒重组系统（Stratgene公司）；限制性内切酶Xba I，Hind III和T4 DNA连接酶（ TaKaRa公司）；限制性内切酶Pac I和Pme I（New England Biolab公司）；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HDMEM培养基和RPMI 1640培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；LipofectAmineTM2000，RTPCR试剂盒和TRIZOLTM试剂（Invitrogen公司）； myc标签， EGFP多克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔抗人βactin多克隆抗体和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗（武汉博士德公司）；ECL化学发光试剂盒为（Pierce公司）。 用于扩增HBx基因的上游引物：5′TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3′，下游引物：5′TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′；用于扩增内参照βactin基因的上游引物： 5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′， 下游引物： 5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′；用于扩增EGFP基因的上游引物：5′ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3′， 下游引物：5′GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3′，上述引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。

　　1.2方法

　　1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的构建

　　经Xba I和Hind III双酶切反应，从pSUPERHBx2，pSUPERHBx5质粒获取RNAi表达框片断HBx2和HBx5（大小300 bp左右），将两目的片断回收后亚克隆入同样经Xba I和Hind III双酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用Xba I和Hind III双酶切，10 mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 获得含小干扰RNA (short interfering RNA， siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.

　　1.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5载体的构建

　　将pShuttleHBx2，pShuttleHBx5质粒用Pme I酶切线性化，与pAdeasy1按10∶1的比例电转化至BJ5183感受态细菌。 卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取较小的克隆扩增培养，提取质粒。 用Pme I酶切鉴定质粒，将鉴定正确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞，扩增阳性克隆并大量提取质粒，得到含针对HBx干涉表达框的重组腺病毒质粒。 （阴性对照质粒AdeasyH1为带有H1启动子的pAdShuttle质粒，用Pme I酶切线性化后与pAdeasy同源重组得到）。

　　1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定

　　①包装细胞培养：含100 mL/L胎牛血清的HDMEM培养基，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养HEK293细胞，当细胞汇合度达70%~80%时转染。 ②重组腺病毒质粒转染HEK293细胞：重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用Pac I酶切线性化后回收，按照LipofectAmineTM2000说明书转染6孔培养板中的HEK293细胞，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，10~12 d后收集细胞，液氮与37 ℃两个温度下反复冻融4次，裂解细胞以收获原始病毒，病毒感染HEK293细胞使病毒大量扩增。 重复上述步骤，最终收集3轮扩增的病毒液，分装保存于-70℃。 ③病毒滴度的测定：用 TCID法检测病毒滴度后，得到1×1010 pfu/mL的病毒工作液。

　　转贴于

　　1.2.4RTPCR检测

　　重组腺病毒对HBx基因mRNA的降解作用制备的重组腺病毒感染人肝癌细胞株HepG2，同时转染表达HBx基因的质粒pCNDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP，后者用来监测各组转染效率，对照组转染只含有H1启动子的质粒AdeasyH1. 37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48 h后，分别收集细胞总RNA和蛋白。 通过RTPCR检测HepG2细胞HBx转录水平的变化：提取实验组和对照组HepG2细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，取5 μg总RNA按照SuperScriptTM Ⅱ说明书进行cDNA第一链的合成 ，以反转录得到的cDNA为模板在PE2400型DNA扩增仪上进行PCR反应。 HBx PCR条件为：95℃变性5 min，再95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。 反应产物为HBx基因片段，长度为464 bp；内参照βactin基因扩增条件为：95℃变性3 min后，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共20个循环，最后72℃延伸5 min，扩增片断大小为438 bp；EGFP基因PCR反应参数为：95℃变性5 min，再95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，共27个循环，最后72℃延伸5 min，反应产物为538 bp。 10 mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，比较干涉组与对照组mRNA水平表达差异。

　　1.2.5Western Blot检测

　　重组腺病毒对HBX蛋白表达的影响用100 μL的细胞裂解液裂解上述各组细胞，4℃ 10 000 g离心20 min，收集上清液，加入等量2×SDS Loading Buffer， 煮沸5 min， 每孔上样30 μL， 蛋白样品经SDSPAGE分离后， 电转移到硝酸纤维素膜上。 依次加入5 g/L脱脂奶粉（室温封闭2 h）， 1∶200 myc标签抗体和EGFP抗体（室温孵育2 h）， 1∶2000的HRP酶标羊抗兔二抗（室温孵育1 h）。 用TBST缓冲液洗涤后，加入底物发光剂ECL 1 mL，反应5 min后吸干发光剂，用单层透明薄膜包裹后曝光，X光胶片显影。

　　2　结果

　　2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的鉴定

　　用Xba I和Hind III双酶切构建的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5，得到6300 bp及300 bp左右的片断（图1），与预期大小一致，证明穿梭质粒构建成功。

　　2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5载体的鉴定

　　用Pme I分别酶切重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5，得到23 000 bp和4300 bp两个片断（图2），结果与预期一致，证明骨架质粒同源重组成功。

　　2.3重组

　　pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5腺病毒的包装含重组腺病毒的质粒转染包装细胞HEK293，培养1 wk后，显微镜下可见特征性圆球状及葡萄串样聚合的细胞病理性改变；电镜下可见病毒感染后的死细胞，胞体肿胀，胞膜不完整，细胞内充满病毒颗粒（图3A，图中箭头所示即为病毒颗粒）， 以及感染细胞的胞核，内有成堆的病毒颗粒（图3B，图中箭头所示为病毒颗粒）。 第10日，可见大部分包装细胞肿胀脱落，细胞出现细胞病理反应（cytopathological effect，CPE）样变化。

　　A： 病毒感染的包装细胞 ×4000； B： 包装细胞胞质内的病毒颗粒 ×40 000.

　　2.4共转HepG2细胞观察HBx基因表达情况

　　包装完成的病毒颗粒以30 MOI感染人肝癌细胞株HepG2，48 h后，分别收集细胞总RNA和蛋白，检测其变化。 RTPCR结果表明，与未处理组和转染空载体组细胞相比，感染腺病毒组细胞的HBx基因mRNA量明显降低（图4A）；Western Blot结果显示，感染腺病毒可使细胞HBX蛋白的表达量显著减少（图4B）。

　　3　讨论

　　目前，在我国广泛应用的抗HBV药物主要有两类，即α干扰素和核苷类药物如拉米夫定等。 但疗效均不理想，新型有效的抗HBV药物仍在探索中。 RNAi用于HBV治疗在理论上具有以下优点［7］：特异性降解HBV mRNA，从而阻止病毒复制，对已整合入宿主细胞基因组的前病毒及无复制活性的病毒，RNAi也可以起到有效的抑制作用，这是通常抗病毒药无可比拟的。 其次，RNAi可以针对病毒基因保守区发挥作用，从而限制病毒产生逃避突变株的能力。 因而，RNAi技术为各类慢性HBV感染开辟了新的途径。 有学者认为RNAi技术应用于抗HBV治疗，有望成为治疗乙型肝炎的革命性新方法，将有巨大的社会价值［8］。 腺病毒载体是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一。 由于腺病毒载体宿主范围广，感染效率高，可插入外源基因片段大，可介导外源基因短时呈高水平表达和不整合到感染细胞的基因组中等特点［9］。

　　在本实验中，我们采用He等［10］创建的pAdeasy腺病毒载体系统，通过细菌体内同源重组的方法，构建针对HBVx基因的两个不同位点的siRNA重组腺病毒载体。 该方法不但发挥了重组腺病毒高效、安全等优点，同时，还具有重组效率高，包装时间短等特点。 腺病毒载体介导的RNA干扰克服了以往用质粒作为siRNA输送载体转染效率低的缺陷。

　　实验中我们使用RTPCR， Western Blot的方法在mRNA水平和蛋白质水平证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒有效地抑制了HBx基因的表达。

　　本实验表明腺病毒是一种有应用前景的抗HBV感染的基因治疗载体， 其可为慢性HBV感染以及HBV感染后发生的肝细胞肝癌的基因治疗提供新思路。

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　　［2］Hwang GY，Lin CY，Huang LM，et al。Detection of the hepatitis B virus X protein(HBX) antigen and antiHBX antibodies in cases of human hepatocellular carcinoma［J］。 J Clin Microbiol，2003， 11(12)： 5598-5603.

　　［3］Tang H， Delgermaa L， Huang F， et al。 The transcriptional transactivation function of HBx protein is important for its augmentation role in hepatitis B virus replication［J］。 J Virol， 2005，79(9)： 5548-5556.

　　［4］彭绍华，厉浩，邓红，等。HBx蛋白和p53蛋白对细胞凋亡的调节及其在肝细胞癌发生中的作用［J］。肿瘤防治杂志，2003， 10（8）： 792-794.

　　［5］Novina CD，Sharp PA。The RNAi revolution［J］。Nature，2004，430：161-164.

　　［6］Dorsett Y， Tuschl T。 siRNAs： Applications in functional genomics and potential as therapeutics ［J］。 Nat Rev Drug Discov，2004，3：318-329.

　　［7］Shlomai A， Shaul Y。 Inhibiyion of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference ［J］。 Hepatology，2003，37(4)：764-770.

　　［8］张岩，刘家云。RNA干扰技术抗乙型肝炎病毒的实验研究进展［J］。医学研究生学报，2005，18：454-457.

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